苏循成，南开大学教授，博士生导师，南开大学元素有机化学国家重点实验室固定研究人员。2001年博士毕业于南开大学化学系，主要研究方向为配位物理化学（导师：陈荣悌）。2001年-2004年在意大利佛罗伦萨欧盟磁共振中心从事利用高分辨核磁共振测定铜结合蛋白质三维结构和蛋白质互作研究（合作导师：Ivano Bertini），并学习了金属蛋白质结构测定方法与顺磁核磁共振的基本理论。2004年-2010年在澳大利亚国立大学化学研究院从事蛋白质定点标记和顺磁核磁共振方法学研究（合作导师：Gottfried Otting）。2010年9月至今在南开大学元素有机化学国家重点实验室工作。

苏循成教授长期从事蛋白质化学和生物磁共振研究。在蛋白质定点修饰、顺磁探针发展和顺磁效应的质量评价与应用方面做出了一些较有原创性的工作，发展了一系列较为实用的蛋白质定点标记方法和应用于细胞内磁共振研究的顺磁探针。已在Acc. Chem. Res.、PNAS 和Angew. Chem. Int. Ed.等期刊发表论文 80 余篇。目前课题组主要集中于蛋白质定点标记化学和生物磁共振方法学，以此研究细胞内蛋白质等生物大分子的高分辨动态结构与互作及功能的关系（见图1）。

图1. 苏循成课题组主要研究方向示意图。

1. 生物核磁研究中顺磁探针拓展、顺磁探针手性与刚性优化及质量评价

核磁共振是从原子分辨角度测定生物大分子结构、互作与动态研究的重要工具，目前是在近生理条件下获取生物大分子复合物原子分辨动态结构的唯一技术。生物核磁中引入顺磁效应可以增强核磁共振检测灵敏度，尤其在测定蛋白质复合物间的相互作用和阐述大分子体系的动态特性方面具有显著的特点。在生物核磁中的顺磁效应中常见的有顺磁弛豫增强（paramagnetic relaxation enhancement, PRE）和赝接触位移（pseudocontact shift, PCS），PRE效应体现距离的信息并且基本具备磁各向同性的特点，而PCS可以提供大分子体系中自旋核的距离和角度信息并且可以快速、精确测定。能产生PCS的一般都是顺磁性的稀土离子配合物，一些过渡金属离子如Fe2+和Co2+的磁各向异性较弱，在生物大分子体系中的应用并不广泛。稀土离子具有较高的配位数，其配合物一般会生成多种手性中心并在溶液中存在不同时间尺度的化学交换。一般来说，逆磁或抗磁的稀土配合物中存在不同手性中心，但是在溶液中较难区分不同手性中心的配位异构体。磁各向异性的稀土配合物中不同手性中心的异构体会表现不同的核磁信号，对于核磁信号和手性异构体的解析具有较高的难度（Ubbink M et al, Chem. Eur. J. 2004, 10, 3252）。在生物核磁研究中需要手性单一的顺磁探针，尤其在解决复杂的大分子复合物体系。早期为制备手性单一的稀土配位化合物一般是利用有机合成获得手性的有机配体（Griesinger C. et al, Chem. Eur. J. 2005, 11, 3342）或者多肽片段（Otting G. et al, JACS 2008, 130, 1681）与稀土离子配位。但是合成单一手性中心的稀土金属离子结合的有机配体本身存在较大的难度并且解决配位原子的潜手性方面仍然待克服，而多肽与稀土配合物的结合强度低，难以广泛利用。苏循成课题组自2010年成立以来一直致力于发展高性能的顺磁探针并应用于复杂生物体系中（Acc. Chem. Res. 2019, 52, 1675），一些具有较高性能特别是应用于细胞内研究的顺磁探针见图2。

图2. 一些应用于生物NMR和EPR研究的高性能顺磁探针。

该团队较早从事这方面的工作。首先通过高强度稀土离子螯合配体间的柔性亚甲基的快速旋转实现生物体系中的单一PCS测量（Chem. Eur. J. 2013, 19, 1097），通过缩短蛋白质与顺磁探针之间的链接臂提高顺磁探针的刚性（Chem. Commun. 2015, 51, 2824）。2019年该课题组在Acc. Chem. Res.上详细论述了不同蛋白质化学修饰方式及顺磁离子在细胞内研究中的应用性，重点讨论了顺磁探针刚性、探针体积（包括疏水和亲水性）、探针结合金属离子稳定性以及热力学和动力学性质对于顺磁效应的影响以及在生物体系中的适用性（Acc. Chem. Res. 2019, 52, 1675），见图3。

图3. 生物核磁研究中顺磁探针的质量评价与适用性以及顺磁探针刚性（动态旋转的空间尺度和时间尺度）对于顺磁效应的影响示意图。图片来源：Acc. Chem. Res. 2019, 52, 1675

近期该团队组提出通过降低金属配合物中螯合配体的动力学交换速率以此增强顺磁探针刚性和提高顺磁手性物种的单一性（J. Phys. Chem. Lett. 2020, 11, 9493）。蛋白质的手性环境均与链接上的顺磁探针存在瞬态的互作，而这类瞬态作用特别受修饰位点影响。对于不同手性的顺磁探针具有明显的差异，表现为不同的结合强度和不同的瞬态作用时间尺度，最近该团队提出通过改变探针与蛋白质修饰位点的手性臂来统一顺磁探针的刚性评价（J. Biomol. NMR 2022, 76, 107）。该团队详细比较了D-类和L-类手性臂的探针修饰到蛋白质不同位点的化学位移变化和顺磁探针刚性参数，结构表明具有D-类手性臂的顺磁探针修饰到蛋白质上后其刚性受修饰位点的影响远远比L-类手性臂探针的小，而这类D-类手性臂顺磁探针刚性的细微差异反映出蛋白质表面修饰位点的动态柔性程度，见图4。

图4. 不同手性臂对于顺磁探针与蛋白质表面互作和顺磁效应的影响。图片来源：J. Biomol. NMR 2022, 76, 107

为区分溶液中顺磁金属配合物的手性物种，该课题组以常用的稀土螯合配体DOTA为母体在其侧臂的取代基中引入F原子并通过19F-NMR定量不同手性组分。通过动力学交换实验详细测定了不同手性物种的化学交换动力学参数并系统比较了自由顺磁探针与定点修饰到蛋白质上以后的动力学和刚性，结果发现动力学化学交换较为活泼的顺磁探针修饰到蛋白质后其手性物种变化易受影响而化学交换动力学较为惰性的顺磁探针在修饰后仍然较倾向于保持自由状态下手性物种的比例（Chem. Commun. 2021, 57, 4291），如图5和图6。

图5. 19F-NMR定量稀土离子配合物溶液中的手性物种。图片来源：Chem. Commun. 2021, 57, 4291

图6. 手性化学交换较明显的顺磁探针修饰蛋白质上后其手性物种比例易受修饰位点环境影响，而化学交换较惰性的顺磁探针在修饰到蛋白质上后倾向于保持其手性物种丰度比。图片来源：Chem. Commun. 2021, 57, 4291

2. 蛋白质定点修饰化学与高效蛋白质偶联反应

生物磁共振研究应用于高分辨蛋白质研究中的化学修饰需要反应条件温和以此保持蛋白质稳定完整的三维结构，并且反应必须具有高选择性。该课题组系统总结了Michael受体与蛋白质自由巯基的反应选择性，并比较了蛋白质不同位点巯基的溶剂暴露程度和位点动态特性与反应活性，发现蛋白质中不同修饰位点的巯基反应活性易受其溶剂朝向、修饰位点局部环境和动态柔性的影响（Asian J. Chem. 2014, 9, 1808）。基于以上研究结果，该团队提出可以根据蛋白质三维结构设计突变位点，通过蛋白质中不同位点半胱氨酸巯基的反应活性差异达到选择性修饰（Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 2914; J. Phys. Chem. Lett. 2018, 9, 6119; Phys. Chem. Chem. Phys. 2019, 21, 10217）。

近期该课题组发现苯砜基取代的吡啶衍生物是一类高选择性和高活性的巯基特异反应基团，通过核磁共振详细研究了苯砜基与小分子巯基和氨基化合物的化学选择性，阐述了反应机制和产物鉴定。该类反应在有机溶剂中不发生，只在水溶液中进行，特别适合于蛋白质的定点修饰（Chem. Commun. 2015, 51, 2824），见图7。

图7. 吡啶苯砜基是一类高选择性的巯基反应试剂，可以应用于温和条件下蛋白质定点修饰。图片来源：Chem. Commun. 2015, 51, 2824

为提高吡啶上的苯砜基对于自由巯基的反应活性，该课题组系统比较了吡啶环上取代基对于该类反应的影响，苯砜基邻位添加溴原子可以使反应提高300多倍并能在近似中性pH下的水溶液中数分钟内达到蛋白质的完全修饰（Chem. Commun. 2015, 51, 2824; Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 2914; Chem. Eur. J. 2021, 27, 16145）。因此苯砜基取代的吡啶衍生物可以作为一类实用的蛋白质巯基反应基团，在蛋白质上定点引入荧光探针和功能磁探针（Acc. Chem. Res. 2019, 52, 1675）。

最近该团队发现苯砜基取代衍生物通过取代基效应可以应用于高效的蛋白质偶联反应，通过吡啶环上的F、PhSO2和其他醛基或酮的组合分步实现：1）F对于自由巯基的定量选择性反应，2）苯砜基对于第二个巯基的亲核取代反应或醛基对于1,2-氨基硫醇的环化反应（Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202205597），见图8。该工作首先通过小分子化合物实现了分步的反应并详细测定了反应的动力学参数，高分辨核磁共振和同位素标记结果证实这类反应对蛋白质的三维结构没有明显影响并且能保持多结构域蛋白质柔性片段区的动态特性（图9）。该偶联反应条件温和，可以在近似生理条件下实现蛋白质近似“无痕”的高效偶联。该偶联反应特别适用于多结构域蛋白质的高效重建、多结构域蛋白质的选择性片段同位素标记，为解决生物核磁研究中的核磁信号重叠提供了有效途径。另外，通过FPPA可以构建三脚架式的蛋白质超分子复合物。

图8. 温和条件下FPPA介导的高效蛋白质偶联反应。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202205597

图9. FPPA介导的高效蛋白质偶联反应能较好地保持蛋白质三维结构和动态特性，适用于高分辨化学生物学和结构生物学研究。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202205597

3. 顺磁核磁共振(pNMR)和电子自旋共振(EPR)及在生物体系中的应用

通过顺磁效应可以放大主-客体作用强弱的信号，并且可以用来评价蛋白质中多结合位点对于客体分子的作用强弱和结合口袋的柔性，该团队早期工作通过顺磁效应（PRE和PCS）系统比较了一个蛋白质中四个客体分子结合口袋的柔性和对客体分子的结合强弱（Chem. Eur. J. 2017, 23, 926）。

蛋白质弱相互作用体系特别是酶催化反应过程中蛋白质复合物过渡态或中间体的三维结构测定缺乏有效的方法。由于该类反应中间体寿命短、丰度低，其结构解析仍然是目前生物物理研究技术的挑战之一。Sortase A是革兰氏阳性菌细胞壁蛋白形成过程中的重要转肽酶，目前已成为筛选抗生素的重要靶标分子。金黄色葡萄球菌的Sortase A是一类广泛应用于在蛋白质偶联反应的工具酶，但是该酶的催化机制缺乏较详细的结构基础研究。该课题组早期研究发现在溶液中Sortase A与其多肽底物能形成不稳定的硫酯中间体，其半衰期在2.5小时以下，最高丰度约50 μM并且随着反应的进行而逐渐下降（图10）。借助该团队发展的高性能顺磁探针和选择性定点标记方法，课题组成员测定了中间体短时间内的PCS，并以PCS为结构约束计算了Sortase A催化中间体的三维结构（Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 13744），见图11。随后，该课题组系统研究了钙离子在催化反应中的作用，结果表明Sortase A对于LPXTG底物具有非常微弱的作用（Kd >100 mM）并且与钙离子结合也不强（Kd ~100 μM）。但是，没有钙离子的情况下Sortase A没有催化作用，而在微量钙离子（~μM）情况下Sortase A的催化作用显著。Sortase A催化LPXTG形成的硫酯中间体是耗能的过程，因此提出从酰胺键形成硫酯键是由于形成的硫酯中间体对钙离子结合程度相较自由蛋白的提高程度实现的（Sci. Rep. 2018, 8, 16371）。

图10. 核磁共振中检测短寿命、低含量Sortase A催化中间体的形成过程。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 13744

图11. 蛋白质定点标记与不稳定酶催化中间体三维结构的PCS测定路线示意图。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 13744

该课题组同时将生物核磁与顺磁探针的经验积累应用于电子自旋共振（EPR）研究。自2013年以来，该课题组与以色列威兹曼研究院的Daniella Goldfarb教授建立了长期的合作关系，主要通过顺磁NMR（pNMR）发展EPR研究领域中生物大分子中的双电子共振（double electron-electron resonance, DEER）测量。通过生物核磁优化的刚性顺磁探针可以提高DEER测定的距离分辨率（Dalton Trans., 2015, 44, 20812），进而致力于发展适用于细胞内DEER测定的顺磁探针并优化提高DEER测定的分辨率和灵敏度，发展了一些性能优异的Gd探针（Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 2914; J. Phys. Chem. Lett. 2018, 9, 6119; Phys. Chem. Chem. Phys., 2019, 21, 10217），见图12。

图12. 高性能Gd探针应用于细胞内蛋白质高分辨DEER测量。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 2914

近期双方通过生物核磁和DEER研究了细胞内环境对二聚体蛋白质的三维结构稳定性和柔性片段区的刚性变化的影响，研究发现蛋白质同源二聚体在细胞内环境下的稳定性比在通常缓冲溶液条件下下降了30余倍，并且不同结构柔性片段区在细胞内中表现出不同的构象受限约束（PNAS 2020, 117, 20556），如图13。另外，课题组与合作者（李从刚研究员和Thomas Huber教授）第一次利用PCS测定了活细胞中蛋白质的三维结构（Chem. Commun. 2016, 52, 10237）。

图13. NMR和EPR联用研究细胞内蛋白质二聚体稳定性。图片来源：PNAS 2020, 117, 20556

该课题组长期从事金属蛋白质研究，在利用核磁共振测定金属蛋白质三维结构和蛋白质间互作行为方面有丰富的研究积累。该课题组发现铜离子(II)与凋亡抑制蛋白质（XIAP）的BIR1作用过程中能氧化N端游离Cys而不会取代掉锌指结合区的锌离子（Sci. Rep. 2017, 7, 16630）。而BIR3结构域均与铜离子(II)和铜离子(I)间均存在作用但是结合能力不同，通过铜离子(II)的PRE效应，阐述了BIR3 N-端结构域表现出与以往核磁共振和晶体结构不同的取向（Sci. Rep. 2019, 9, 7428）。常见的过渡金属离子在溶液中能促进α-突触核蛋白质的聚集从而形成寡聚体和纤维，这些报道的金属离子基本具有活泼的动力学特性。该课题组提出通过动力学惰性金属离子与α-突触核蛋白质形成的动力学惰性的配合物抑制该蛋白质的聚集（ChemBioChem 2019, 20, 1953）。研究发现顺铂在与α-突触核蛋白作用过程中解离所有的氨基和氯离子从而与蛋白质形成稳定的1:1的配合物。利用同位素标记和高分辨核磁共振，详细阐述了Pt(II)能与该蛋白质中的Met和His残基形成稳定的金属配合物，从而抑制了蛋白质的聚集，见图14。这类动力学惰性的金属离子表现出与常见动力学活性的锰离子、铜离子和锌离子在与蛋白质作用过程中呈现出迥异的性质，该发现对应用动力学惰性金属离子抑制蛋白质聚集提出了新思路。最近该课题组发现Pt(IV)能选择性氧化α-突触核蛋白中的Met侧链，并且在氧化过程中伴随着还原产物Pt(II)与N-端 Met1的配位，通过高分辨核磁共振发现在α-突触核蛋白质中包含四个Met（M1, M5, M116和 M127）的区域存在长程的瞬态互作，说明这类固有无序蛋白质中长程互作的存在（Inorg. Chem. Front. 2023, 10, 296）。

图14. 顺铂抑制α-突触核蛋白聚集的分子机制。图片来源：ChemBioChem 2019, 20, 1953

4. 生物有机分析与活细胞中重要功能小分子同时定量的核磁共振方法

该课题组发展了利用19F-NMR同时定量测定生物流体和活细胞内重要功能小分子的方法。通过反应性的19F探针，课题组实现了生物流体如血清和细胞裂解液中多种氨基酸的同时定量测定。这类19F探针标记的氨基酸小分子由于氨基酸侧链取代基的差异直接反映到19F的化学位移上，这种测定方法避免了可逆检测体系中化学反应平衡移动造成的化学位移的不确定性和待检测物浓度高低对反应平衡移动的影响。通过两种19F探针可以实现20种氨基酸的同时定量，并且检测限度达到~μM级（Chem. Commun. 2021, 57, 13154），见图15。通过这类19F探针可以同时定量生物硫醇，由于该类探针与自由巯基生成稳定的硫酯衍生物，该类衍生物与酰胺衍生物具有明显的19F化学位移差别，见图16。在此基础上作者进一步测定了不同种类活细胞中GSH的稳态平衡并发现GSH在癌细胞表面有明显的水解而正常细胞GSH存在明显的稳定性，通过活细胞的19F-NMR方法，该团队详细测定了GSH水解机制和水解产物（Anal. Chem. 2022, 94, 901），见图17。

图15. 生物流体中同时检测和定量测定氨基酸的19F-NMR方法。图片来源：Chem. Commun. 2021, 57, 13154

图16. 19F-NMR探针同时检测和定量测定生物硫醇示意图。图片来源：Anal. Chem. 2022, 94, 901

图17. 19F-NMR测量不同细胞系中的GSH稳定性。图片来源：Anal. Chem. 2022, 94, 901

手性识别特别是定量分析是化学测量学和主-客体研究领域中的重要内容，如何在生物流体中或近生理状态下实现多种手性组分的同时定量仍然具有较大困难。该课题组前期通过19F-NMR可以实现手性金属配位化合物的手性定量（Chem. Commun. 2021, 57, 4291）。最近通过在一个手性碳原子中心引入一个F原子通过该19F探针与氨基酸的反应形成稳定衍生物，不同D/L-氨基酸衍生物中19F的化学位移具有明显的化学位移差异（图18），通过比较不同氨基酸衍生物的化学位移可以实现多种手性氨基酸的同时定量（Anal. Chem. 2022, 94, 7853）。

图18. 手性19F-探针同时检测和定量D/L-氨基酸，其中D/L氨基酸与手性19F-探针形成的衍生物具有显著的化学位移差异。图片来源：Anal. Chem. 2022, 94, 7853

与其它检测技术类似，探针或主体的手性识别能力主要是待测物手性中心与报告检测中心的空间立体环境或者作用强弱密切相关，在19F-NMR中手性识别能力主要决定于19F报告基团中的中心距离与待测物中的手性中心的空间距离以及两个手性中心连接臂的柔性。该课题组以脂肪胺为例，通过不同种类的R/S-氨基化合物与手性19F-探针形成衍生物，系统研究了R/S衍生物的化学位移差值、待测物中取代基团大小和溶剂效应对于手性识别能力的影响。灵敏度高的手性19F探针中心距离对距离待测物五个柔性亚甲基的手性中心具有明显的识别能力，并且待测物中靠近手性中心增大取代基可以提高手性识别能力，并且溶剂极性对于不同待测物的极性表现出明显的19F-化学位移差别（Analyst 2023, 148, 233），见图19。

图19. 多种手性化合物的同时检测和定量。图片来源：Analyst 2023, 148, 233